Novela dual

May 20, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12547 (2023) Citar este artículo

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Cada año se desperdicia una gran cantidad de subproductos de los cítricos. Existe una gran necesidad de utilizar estos subproductos con alta eficiencia. Este estudio se centra en el aislamiento del aceite esencial (EO) de la ralladura de los subproductos de Citrus sinensis (CS), utilizando un novedoso prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado con espectrometría de masas y cromatografía de gases de doble función (DF-GC/MS- SUH). El CS-EO se analizó por GC mediante un detector MS (GC/MS) y se optimizó mediante un detector de ionización de llama (GC/FID). La hidrodestilación asistida por ultrasonido (HUS) tenía una doble función en el aislamiento de CS-EO al utilizar una energía adecuada para abrir las glándulas que contienen aceite y al funcionar como agente dispersante para emulsionar la fase orgánica. Las condiciones optimizadas para DF-GC/MS-HUS más efectivas fueron el aislamiento a 38 °C y 10 minutos de sonicación a 28,9 Hz. Los componentes principales del CS-EO fueron limoneno, β-mirceno y α-pineno (81,32%, 7,55% y 4,20%) en el prototipo, en comparación con (60,23%, 5,33% y 2,10%) en el modelo convencional. método, respectivamente. El prototipo CS-EO mostró potencial antibacteriano natural e inhibió la formación de biopelículas por Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y E. coli de manera más potente que el método convencional. En comparación con el método convencional, el método prototipo disminuyó el tiempo de aislamiento en un 83,3%, redujo el consumo de energía, sin producción de dióxido de carbono, al reducir las temperaturas de aislamiento en más de la mitad, lo que protegió a los componentes termolábiles, y aumentó la cantidad en 2514 veces y mejoró la calidad de la composición de CE-EO y su potencial antibacteriano. Por lo tanto, el método prototipo DF-GC/MS-HUS se considera una nueva técnica ecológica que minimiza la utilización de energía con mayor eficiencia.

La producción de frutos de Citrus sinensis (CS) ha sido considerada uno de los primeros productos naturales en la región del Mediterráneo oriental. Esta fruta crece en la mitad sur de la costa libanesa y representa la mitad de la producción agrícola total del país. La producción de CS aumentó durante el año 2001 y alcanzó su punto máximo en 2004, alcanzando una producción de 395.300 toneladas. Debido a la guerra de 2006, esta producción disminuyó hasta situarse en un rango de 230.497 toneladas en 20131. En la industria manufacturera, estas frutas se utilizan para la producción de zumos (frescos o comerciales) o de cítricos, lo que genera una gran cantidad de residuos, en su mayoría cáscaras, se desechan. Las industrias buscan un procedimiento de gestión de residuos para minimizar la costosa eliminación de estos materiales de desecho2.

El desperdicio de alimentos siempre ha sido un problema mundial, donde cada año se pierde y no se utiliza una gran cantidad de subproductos. Aislar el aceite esencial de los subproductos de los cítricos se considera un enfoque válido para minimizar el desperdicio de frutas y valorizarlo mediante la producción de conservantes alimentarios, saborizantes y cosméticos3. Los desechos de los cítricos contienen compuestos valiosos en su pulpa, semillas y cáscaras4, como flavonoides, fibras dietéticas, polifenoles, carotenoides, ácidos ascórbicos y aceites esenciales2.

Se sabe que los polifenoles y carotenoides tienen diversos beneficios para la salud, especialmente sus actividades antioxidantes, debido a que su contenido de polifenoles presenta una variedad de propiedades biológicas reportadas, como antiagentes para la piel, anticancerígenos y antialérgicos5. Además, desempeñan un papel importante en los campos cosmético y farmacéutico. Los aceites esenciales (AE) son una combinación de muchos compuestos, pero se componen principalmente de fenilpropanoides, monoterpenos y sesquiterpenos, que son responsables del aroma de diferentes plantas y pueden usarse en la industria farmacéutica. Se pueden agregar a los nutracéuticos para realzar el sabor y pueden usarse como antimicrobianos naturales4. Los investigadores descubrieron que los aceites esenciales de cítricos pueden controlar el crecimiento de una amplia gama de bacterias sin causar ningún efecto perjudicial para la salud6.

El aislamiento de aceites esenciales se puede realizar de forma convencional utilizando diferentes métodos como; extracción con solventes, prensado en frío y destilación7. Cada método de aislamiento convencional tiene algunas ventajas y muchas desventajas. La extracción con disolventes tiene un alto rendimiento, pero los disolventes son caros y difíciles de eliminar8. Además, el prensado en frío tiene aceite de alta calidad pero de bajo rendimiento9. Sin embargo, los métodos de destilación convencionales tienen mayor rendimiento pero son de baja calidad y tienen un alto consumo energético10. Además, existen muchos estudios sobre la mejora de la hidrodestilación convencional (HD), como la extracción asistida por microondas (MAE), la HD asistida por campo eléctrico pulsado (PEF-HD) y la hidrodestilación asistida óhmica (OAHD). Sin embargo, la necesidad de un aparato especial, una menor selectividad y una reacción inevitable a temperaturas más altas son las principales desventajas de MAE11. Además, PEF-HD tuvo sus inconvenientes que incluyen la reversibilidad de los cambios de membrana y la formación de burbujas de aire, lo que reduce la eficiencia general del método12. Sin embargo, el OAHD tenía varias desventajas, incluido el enorme costo del equipo, el riesgo de fuga térmica y la insuficiencia para calentar directamente los yacimientos de petróleo13. Por lo tanto, existe una necesidad cada vez mayor de un método de aislamiento novedoso que acorte el tiempo de aislamiento, consuma menos energía y no produzca dióxido de carbono, con alto rendimiento, calidad y eficiencia. Por lo tanto, el trabajo actual tiene como objetivo optimizar fitoquímicamente un prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido asistida por GC/MS de doble función (DF-GC/MS-HUS) utilizando aceite esencial de Citrus sinensis (CS-EO) a partir de subproductos. Además, también se investigaron los potenciales antioxidantes in vivo y antibacterianos in vitro.

La ralladura de Citrus sinensis (CS), resultante del prensado de CS, se recolectó (primavera de 2019) y se preparó en dos establecimientos de jugo diferentes ubicados en Beirut, área de Tarik El Jdideh, Líbano. CS fue transportado recién en contenedores bien cerrados en un vehículo privado a la sombra. Las cáscaras de las cáscaras de CS se obtuvieron utilizando un pelador (Pedrini, modelo 6018-8AA, Italia). La investigación experimental y los estudios de campo sobre plantas CS cultivadas en Akar, Líbano, incluida la recolección de material vegetal, cumplen con las leyes nacionales de cultivo y recolección pertinentes.

Los productos químicos y disolventes utilizados en el estudio del método convencional fueron de calidad analítica. Además, los productos químicos, disolventes y estándares utilizados en el método prototipo y el análisis por GC eran de calidad GC. Todos los productos químicos, disolventes y estándares se adquirieron comercialmente en Sigma-Aldrich (EE. UU.), a menos que se indique lo contrario. En todos los experimentos se utilizó agua bidestilada, siempre que fuera necesario. El caprato de etilo, estándar interno de GC, se adquirió de Thermo Scientific Chemicals, EE. UU.

Se operó un Waters GC–FID–MS (Waters APNT1545129, Japón) para realizar el análisis en línea con el proceso de extracción. El DF-GC/MS-HUS se ha ensamblado con un hidrodestilador Clevenger modificado de acero inoxidable con cuatro transductores de ultrasonido optimizados operados con control central para variar la frecuencia del ultrasonido, la sonicación y el tiempo de destilación, para obtener el máximo rendimiento en el mínimo tiempo. de acuerdo con la representación esquemática en la Fig. 1 y S1. El inyector dividido en línea se utilizó para la separación y cuantificación de compuestos de aceites esenciales14. El GC–FID–MS de Waters se operó utilizando una columna capilar de 5 MS (30 m * 0,25 mm * 0,25 μm) además de un detector de ionización de llama (FID) de Waters y un detector de masas operado en modo EI. El hidrógeno (FID) y el helio (MS), los gases portadores, fluyen a una velocidad de 1 ml/min, relación de división de 1:30 y se ajustan a 250 °C. La temperatura del horno se programó de la siguiente manera; 50 °C a 5 °C por minuto (5 min) 140 °C a 7 °C por minuto y a 275 °C (10 min)14. La hidrodestilación asistida por ultrasonido (HUS) optimizada tuvo una doble función en la extracción del CS-EO. Principalmente, se utilizó el hidrodestilador ultrasónico HUS como fuente de energía adecuada para abrir las glándulas que contienen aceite y liberar el CS-EO. En segundo lugar, se utilizó un transductor ultrasónico HUS como agente dispersante para emulsionar la fase orgánica en agua bidestilada en el matraz de destilación. Se han utilizado tres sondas de ultrasonido integradas con una alimentación de 90 a 250 VCA y el ciclo de pulsación está configurado en 9,9 s. encendido y 9,9 s. apagado y ca. promedio Densidad de potencia de 0,2 VCA/cm2. Garantizamos que no haya falsos positivos al realizar una prueba de drogas confirmatoria TLC-UV secundaria en cualquier resultado positivo importante15.

Prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado para GC/MS de doble función (DF-GC/MS-HUS). (A) Hidrodestilador Clevenger modificado (parte superior). (B) Transductor de ultrasonido integrado (parte inferior). (C) Control por ultrasonido. (D) Control Central. (E) GC-FID-EM.

Los datos del espectro de masas se obtuvieron utilizando el modo de exploración completa (m/z 50–300) y una relación de división de 1:30. Las muestras de CS EO se diluyeron con n-hexano en una proporción de 1:500 (v/v) y para el análisis se utilizó caprato de etilo (estándar interno, 0,38 mg/ml)16.

Cada muestra se procesó en la siguiente secuencia: blanco, muestra de CS EO, blanco, muestra de CS EO, blanco, CS EO y blanco al final. Cada muestra se analizó por triplicado y cada ejecución duró 30 minutos. Las identidades de los compuestos separados se han evaluado comparando sus tiempos de retención, índices de retención y espectros de masas con los de los estándares de referencia disponibles.

Los otros componentes separados obtenidos de las series se seleccionaron de la biblioteca de espectros de masas del NIST en función de sus datos de masa y sus identidades se confirmaron utilizando sus índices de retención lineal (LRI) en relación con los n-alcanos (C8-C20).

La ralladura de CS se sumergió en 200 mL de agua destilada en una proporción de 1:2, respectivamente. La ralladura se dispuso en un calentador redondo conectado a un hidrodestilador Clevenger (CCH) convencional para asegurar el aislamiento de CS-EO. El CCH se mantuvo durante 6 h a 100 °C. Y al finalizar la destilación se obtuvieron dos fases; una fase acuosa (agua aromática) y el AE, menos denso que el agua. El aceite esencial CS se almacenó a -80 °C antes del análisis17.

Después de pelar el CS para obtener la ralladura, se tomó el peso de la ralladura utilizando una balanza eléctrica (Ohaus PR124ZH, China). El volumen de aceite CS aislado se tomó usando una micropipeta después de separar las fases de agua y aceite mediante centrifugación (40 °C, agitación a 400 rpm). El rendimiento de CS EO aislado se expresó en ml y el tiempo de aislamiento por los dos métodos se expresó en horas18.

Actualmente, el modelado cinético para el aislamiento de aceite de cáscara de CS mediante el método prototipo se realizó utilizando modelos de primer y segundo orden.

La ecuación cinética de pseudo primer orden: dCt/dt = k1(Cs − Ct), donde Cs es la capacidad de aislamiento, Ct es la concentración de aceite esencial en cualquier momento t (min), y k1 (min−1) es la constante de tasa de aislamiento de primer orden. Los Cs y k1 podrían calcularse utilizando la intersección y la pendiente de la gráfica19.

La ecuación cinética de segundo orden: dCt/dt = k2(Cs − Ct)2, donde k2 (L g−1 min−1) es la constante de velocidad de aislamiento de segundo orden.

La tasa de aislamiento inicial (h), la capacidad de aislamiento (Cs) y la constante de tasa de aislamiento de segundo orden (k2) se pueden estimar prácticamente a partir de la intersección y la pendiente de una gráfica que involucra t/Ct y t19,20.

Dos aceites esenciales comerciales de CS aislados utilizando los métodos convencional y DF-GC/MS-HUS se evaluaron por separado biológica, analítica y bioquímicamente.

El potencial antioxidante se evaluó utilizando catalasa sérica (CAT) in vivo, radicales libres in vitro/1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y ensayo ABTS in vitro21,22,23. Los niveles de CAT in vivo se han medido (kU/l) mediante un método adaptado descrito anteriormente23. El método DPPH in vitro se evaluó utilizando diferentes concentraciones de todos los aceites esenciales (25, 50, 100 μg/ml) que se diluyeron cinco veces con una solución de DPPH en metanol 0,4 mM. El blanco consistió en una solución metanólica de DPPH 0,4 mM. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reducción del número de radicales libres se medirá leyendo la absorbancia a 517 nm utilizando un espectrofotómetro. El porcentaje de inhibición de los radicales DPPH por cada AE se calculará según la siguiente fórmula: % de inhibición = [(AB − AA)/AB] × 100, donde AB absorción de la muestra en blanco (t = 0) y AA = absorción de aceite probado (t = 30 min). La concentración inhibidora media máxima: los valores de IC50 que representan la concentración de EO que causó el 50 % de eliminación se determinarán a partir de la gráfica del porcentaje de inhibición frente a la concentración22. Los niveles del ensayo ABTS in vitro se midieron mediante un método descrito anteriormente21.

El RI de ambas muestras de aceite CS se midió utilizando un refractómetro digital REF 123®. La medición se realizó a 20 ± 0,2 °C14.

Según24, la densidad relativa del aceite esencial se calculó utilizando la siguiente fórmula: la relación entre la masa de la muestra líquida y la masa de agua.

donde C = densidad g/mL, m = masa por g y V = volumen por ml.

Según el método descrito por Taga et al. (1984), se disolverán 100 uL de cada muestra de aceite esencial CS en 10 ml de MeOH de 0,4 mm y se completarán 2 ml de esta solución con ácido clorhídrico al 0,3% hasta 5 ml. Se agregará una alícuota de 100 µL de la solución resultante a 2 ml de carbonato de sodio (Na2CO3) al 2 % y, después de 2 minutos, se agregarán y mezclarán bien 100 µL de reactivo de Folin-Ciocalteau (diluido con MeOH 1:1). Después de 30 min de incubación, la absorbancia de las mezclas se registrará espectrofotométricamente a 750 nm según el método utilizado por22.

El contenido fenólico total se calculará como equivalente de ácido gálico (GAE) a partir de una curva de calibración de soluciones estándar de ácido gálico y se expresará como mg de ácido gálico por 100 μL de muestra de aceite esencial22.

En una placa de agar (PCA), se agregaron 50 μL de aceite y se rotaron suavemente para asegurar una mezcla uniforme del aceite con el agar. Las placas se incuban a 30 °C durante 48 h. El análisis microbiológico del aceite se realizó en el laboratorio de Microbiología (Instituto Libanés de Investigación Agrícola (LARI), Fanar, LÍBANO).

Sobre un agar bilis rojo violeta se agregaron 50 ul de aceite y se esparcieron sobre el agar. Las placas se incuban a 37 °C durante 24 h.

En este estudio se utilizaron dos aceites esenciales comerciales de CS y el aceite extraído por el prototipo. Los aceites se disolvieron primero en dimetilsulfóxido (DMSO) 1:1 (v/v) para dar soluciones madre (50 % v/v). Para el bioensayo, las soluciones madre de aceites esenciales se esterilizaron utilizando filtros de jeringa desechables de 0,45 μm antes de evaluar su efecto antimicrobiano. Las soluciones madre de aceites esenciales se almacenaron en botellas oscuras en el refrigerador a 4 °C para su uso posterior.

Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por el Departamento de Ciencias de la Salud de la Universidad Árabe de Beirut (BAU) y el Centro Médico de la Universidad Americana de Beirut (AUBMC). Se probaron dos cepas de bacterias grampositivas (Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes) y dos cepas de bacterias gramnegativas (E.coli y Pseudomonas aeruginosa) contra los dos aceites esenciales comerciales de CS y el aceite extraído mediante prototipo y se usaron para formar monocitos. biopelículas de especies. Los cultivos de bacterias se mantuvieron en sus inclinaciones de agar apropiadas a 4 °C durante todo el estudio y se utilizaron como cultivos bacterianos madre.

Los inóculos bacterianos se obtuvieron de cultivos madre y se inocularon en caldo Lysogeny y luego se incubaron a 37 ° C durante 18 a 24 h. A partir de los cultivos recién cultivados se realizaron diluciones decimales en solución salina estéril (0,9%) hasta alcanzar una turbiedad de 0,5 McFarland (108 UFC/mL), para probar los efectos antibacterianos de los aceites esenciales6.

La actividad antibacteriana de los aceites esenciales se examinó por primera vez mediante el método de difusión en disco de agar, que es el ensayo preliminar para detectar la actividad antibacteriana de los aceites esenciales y seleccionar entre los eficientes25. La difusión en disco de agar se realizó utilizando un cultivo bacteriano durante la noche, donde se recogieron 3 colonias de cada cepa a analizar y se inocularon en solución salina estéril y se ajustaron a aproximadamente 108 UFC/mL, luego se esparcieron 100 µL de las suspensiones bacterianas preparadas sobre placas de Agar Mueller-Hinton (MHA) y se dejó durante 15 min a temperatura ambiente. Para mejorar la difusión en el agar, los aceites esenciales se mezclaron con DMSO acuoso al 10 % y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de membrana de 0,45 μm26. En condiciones asépticas, se pipetearon 5 μL de aceites esenciales en DMSO (1:1) en discos de papel de filtro esterilizados de 5 mm colocados en la parte superior de las placas de MHA inoculadas y se mantuvieron durante 30 minutos en el refrigerador para permitir la difusión del aceite. Se utilizó como control negativo un disco de papel de filtro impregnado con DMSO, mientras que como control positivo se utilizó un disco estándar que contenía gentamicina (10 μg/disco). Todas las placas se incubaron a 37 °C durante 18 a 24 h. Después de una incubación durante la noche, se registraron las zonas de inhibición6.

Los valores de CIM se determinaron para los aceites esenciales que mostraron potentes efectos antibacterianos contra los aislados analizados utilizando el método de dilución en agar recomendado por el Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS) con algunas modificaciones6. Para mejorar la solubilidad de los aceites esenciales, se añadió al medio MHA una concentración final de 0,5% (v/v) de Tween-20. Primero, se prepararon soluciones madre de cada aceite esencial analizado (100 mg/ml), seguidas de una serie de diluciones dobles en caldo Mueller-Hinton, lo que dio como resultado seis concentraciones (50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml). mL, 6,25 mg/mL, 3,12 mg/mL y 1,56 mg/mL), luego se añadió 1 ml de cada dilución en serie preparada a 9 ml de agar Mueller Hinton derretido a 48 °C, se mezcló bien y se vertió en placas estériles. Las placas se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la mancha con alícuotas de 3 µL de cultivos bacterianos que contenían aproximadamente 104 UFC/mL de cada aislado analizado. Las placas inoculadas se incubaron a 37 ° C durante 18 a 24 h y se determinaron los valores de CIM. Se utilizaron placas de MHA sin aceites esenciales como control negativo del crecimiento. Los valores de CMI se consideraron como la concentración más baja de aceite que resulta en la inhibición del crecimiento bacteriano visible en la placa de agar27.

Para evaluar el efecto de los aceites esenciales en la formación de biopelículas, se realizó un ensayo de biopelícula en la superficie del vidrio, donde la biopelícula adherida a los cubreobjetos de vidrio se visualiza bajo el microscopio óptico28. Cada cepa bacteriana se cultivó durante la noche en caldo nutritivo y se diluyó 1:5 en caldo Luria-Bertani (LB); los cultivos diluidos se utilizaron para sumergir un cubreobjetos estéril. En este estudio, se utilizaron vasos de precipitados estériles para cada cepa bacteriana que contenían un cubreobjetos de 2,5 cm, se agregaron 300 μL de suspensión bacteriana con un volumen igual de aceite esencial que muestra un potente efecto antibacteriano contra cada aislado, y el vaso de precipitados sin tratar se usó como control de referencia. . Después de una incubación durante la noche a 37 °C, cada vaso se lavó 3 veces con agua destilada, se fijó con etanol al 95% durante 30 minutos y luego se tiñó con violeta cristal al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final, todos los cubreobjetos se secaron y se visualizaron microscópicamente para detectar la formación de biopelículas, y todas las pruebas se realizaron por triplicado6.

Los resultados se expresan como media ± DE. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para probar las diferencias en los grupos y se utilizó una prueba de significancia de rangos múltiples. Se aplicó la prueba de Tukeys para examinar las medias en p < 0,05. Para las presentaciones gráficas se utilizó el programa OriginPro 2021 (Origin Lab; Northampton, MA, EE. UU.).

Cada año se desperdicia una enorme cantidad de subproductos de los cítricos. Existe una necesidad cada vez mayor de utilizar estos subproductos con alta eficiencia. Por lo tanto, este estudio se centra en el aislamiento de EO de subproductos de Citrus sinensis (CS), utilizando un novedoso prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado para GC/MS de doble función. En este estudio, se realizó el aislamiento de aceite esencial a partir de subproductos de CS, utilizando un novedoso prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado por GC/MS de doble función (DF-GC/MS-HUS). El aceite esencial CS (CS-EO) se analizó por GC mediante un detector MS (GC/MS) y se optimizó mediante un detector de ionización de llama (GC/FID).

Para maximizar el rendimiento en el tiempo mínimo, el prototipo DF-GC/MS-HUS se optimizó variando la frecuencia del ultrasonido, la sonicación y el tiempo de destilación. Los detalles de las principales condiciones optimizadas de DF-GC/MS-HUS se resumen en la Tabla S1. Las condiciones optimizadas para DF-GC/MS-HUS más efectivas fueron el aislamiento a 38 °C de temperatura optimizada y 10 min de sonicación a 28,9 Hz, y 60 min de destilación. El rendimiento fue de 8,80 ± 0,01 ml de CS-EO (prototipo) por hora (Tabla 1). El rendimiento relativamente mayor podría deberse a que la hidrodestilación asistida por ultrasonido (HUS) tiene una doble función en la extracción de CS-EO. Principalmente, el HUS se utilizó como fuente de energía adecuada para abrir las glándulas que contienen aceite y liberar CS-EO. En segundo lugar, se utilizó HUS como agente dispersante para emulsionar la fase orgánica en agua bidestilada. Para evaluar la eficiencia del método prototipo, el prototipo CS EO fue analizado mediante GC-MS para la separación e identificación de los componentes CS EO. La GC/MS en línea indicó que los componentes principales del CS-EO aislado (prototipo) eran limoneno (81,32%), β-mirceno (7,55%) y α-pineno (4,20%) (Tabla 4).

El CS-EO se aisló de CCH (CS-EO convencional) y el rendimiento fue de 0,35 μl por 6 h de destilación. El análisis GC/MS CS-EO (convencional) ha mostrado una disminución en la cantidad de los componentes principales y un aumento de artefactos, lo que indica una calidad general más baja del aceite. Esta inferioridad en la calidad del CS-EO podría deberse a la utilización de altas temperaturas y al mayor tiempo de extracción del CS-EO. Para estimar la eficiencia del método CCH, GC-MS analizó el CCH CS EO para evaluar los componentes de CCH CS EO. Los principales componentes del método convencional han mostrado limoneno (60,23%), β-mirceno (5,33%) y α-pineno (2,10%) (Tabla 4).

Se observó una diferencia en el tiempo de extracción entre el prototipo DF-GC/MS-HUS y el CCH convencional (Tabla 1). La hidrodestilación de CCH convencional requirió 6 h para extraer un volumen de 0,35 μL, mientras que el aislamiento del prototipo DF-GC/MS-HUS se optimizó durante 60 min para obtener un aumento de rendimiento de 2514 veces. Así, el prototipo DF-GC/MS-HUS ha demostrado superioridad en eficiencia de extracción. En comparación con el método de hidrodestilación convencional, el método prototipo DF-GC/MS-HUS ha acortado el tiempo de extracción en un 83,3%, ha reducido el consumo de energía, sin producción de dióxido de carbono, al reducir las temperaturas de extracción a más de la mitad, lo que protege a los termolábiles. componentes, aumentó la cantidad en 2514 veces y mejoró la calidad de la composición CE-EO. Para evaluar la eficiencia del método prototipo con hidrodestilación convencional, los aceites esenciales mediante estos dos métodos se analizaron mediante GC-MS para la separación e identificación de los componentes de CS EO. Los componentes principales del prototipo aislado de CS-EO fueron limoneno (81,32%), β-mirceno (7,55%) y α-pineno (4,20%). Por otro lado, el método convencional ha mostrado limoneno (81,32%), β-mirceno (5,33%) y α-pineno (2,10%) como los componentes principales convencionales. Por lo tanto, el método prototipo DF-GC/MS-HUS se considera una nueva técnica ecológica que minimizó la utilización de energía con mayor eficiencia. Estos resultados fueron comparables a otros sistemas optimizados informados anteriormente4.

La cinética de primer y segundo orden se ha estudiado utilizando los métodos prototipo CCH y DF-GC/MS-HUS (Fig. 2). Cuando se realizó el modelado cinético, se encontró que el modelo cinético de segundo orden era capaz de representar los resultados prácticos de la extracción de aceite CS utilizando la hidrodestilación convencional y los métodos prototipo en comparación con el modelo cinético de primer orden (Tablas 2, 3). Además, el porcentaje de rendimiento podría usarse para demostrar que el modelo cinético de segundo orden era capaz de representar los resultados prácticos del aislamiento de aceite de CS utilizando la hidrodestilación convencional y los métodos prototipo en comparación con el modelo cinético de primer orden, como se había considerado anteriormente con aceites esenciales similares19. . Actualmente, los requerimientos de consumo eléctrico para la extracción de aceite CS mediante el método convencional (hidrodestilación) y el método prototipo fueron de 7,10 y 1,18 kW h, respectivamente. Por lo tanto, se podría concluir que la extracción de aceite CS utilizando el método prototipo conservó la energía 6 veces en comparación con el método de hidrodestilación convencional29. Estos resultados están en línea con otros sistemas optimizados informados anteriormente con aceites esenciales similares4,30.

Una comparación de los modelos cinéticos de primer y segundo orden con los resultados experimentales para la extracción de aceite de naranja mediante (A) método de hidrodestilación convencional y (B) método prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado por GC/MS de doble función (DF-GC). /MS-HUS).

Generalmente, el impacto ambiental de la extracción de E.Os se puede ver en las emisiones de dióxido de carbono producidas. Las emisiones de dióxido de carbono producidas en la extracción de petróleo CS utilizando el método convencional CCH y el método prototipo DF-GC/MS-HUS son iguales a 4,9 y 0,96 kg, respectivamente. Así, en general, se puede decir que la extracción de aceite CS utilizando el método CCH convencional (hidrodestilación) produce cinco veces más emisiones de dióxido de carbono en comparación con el método prototipo. Por lo tanto, el uso del método prototipo DF-GC/MS-HUS para la extracción de petróleo CS podría considerarse una nueva técnica ecológica en comparación con los métodos CCH convencionales29.

Al comparar la calidad del aceite esencial de CS aislado utilizando CCH y los métodos prototipo de aislamiento, los componentes principales del CS-EO aislado fueron limoneno (81,32%), β-mirceno (7,55%) y α-pineno (4,20%). ) predominaron con el método prototipo DF-GC/MS-HUS. Esto podría deberse a la ventaja del prototipo, ya que el aceite se aísla durante un tiempo más corto a una temperatura más baja en comparación con el método CCH convencional. Con referencia al impacto ambiental, la cantidad calculada de dióxido de carbono expulsado a la atmósfera es mayor en el caso del método convencional (aprox. 3464 g CO2/g de EO) que para el prototipo (aprox. 199 g CO2/g de EO). ) (Tabla S2), como ya se estableció anteriormente31. Según estos hallazgos, el método prototipo ha mejorado la calidad del aceite esencial de CS al tiempo que utiliza menos energía, menor consumo de tiempo, menores emisiones de dióxido de carbono y mayor rendimiento. Por lo tanto, el método prototipo DF-GC/MS-HUS se considera una nueva técnica ecológica que minimizó la utilización de energía con mayor eficiencia, como se demostró anteriormente con técnicas comparables32,33,34.

Los aceites esenciales de CS aislados utilizando los métodos convencional y DF-GC/MS-HUS se evaluaron por separado biológica, analítica y bioquímicamente (Tabla 4).

Los niveles de CAT in vivo son responsables de la reducción celular normal del daño oxidativo que inicia el dolor neuropático. Los niveles séricos de CAT se evaluaron antes y ocho semanas después de la administración de 10 mg/kg de aceite CS aislado mediante métodos convencionales CCH y DF-GC/MS-HUS (Fig. 3). Después de ocho semanas de administración de 10 mg/kg de aceite CS (DF-GC/MS-HUS), los niveles de CAT han mostrado una elevación de 59,57 ± 0,55 % (Fig. 3). Por otro lado, los niveles de CAT han mostrado una elevación de 24,10 ± 0,14%, después de ocho semanas de aceite CS convencional (Fig. 3).

Análisis de antioxidantes CAT in vivo. Animales normales NORM, animales tratados con vehículo VEH, hidrodestilación Clevenger convencional CCH (10 mg/kg), prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizada para GC/MS de doble función DF-GC/MS-HUS (10 mg/kg), VC 7 mg /kg de vitamina C.

De acuerdo con la tasa de eliminación de radicales libres de DPPH del CS EO en diferentes concentraciones, el aceite obtenido por el prototipo DF-GC/MS-HUS y los aceites esenciales aislados de CCH convencionales, y como se muestra en (Fig. 4), la actividad de eliminación de DPPH de aceite aumentó significativamente (p < 0,05) al aumentar la concentración de aceite. El prototipo CS EO aislado de DF-GC/MS-HUS presenta el mayor porcentaje de tasa de eliminación de radicales libres en todas las concentraciones: 36,00 ± 0,21 %, 41,00 ± 0,15 % y 57,00 ± 0,26 % en 25 μg/mL, 50 μg/mL, y 100 μg/mL, respectivamente (Fig. 4). El AE aislado de CCH convencional ha demostrado tener el % más bajo de actividad eliminadora de radicales DPPH, 10,00 ± 0,05 %, 11,50 ± 0,11 % y 14,80 ± 0,05 % en 25 ug/ml, 50 ug/ml y 100 µg/ml, respectivamente. (Figura 4). El prototipo CS EO de DF-GC/MS-HUS tiene una IC50 de 87,7 μg/ml, el EO aislado de CCH convencional tiene una IC50 de 337,83 μg/ml. El prototipo CS EO extraído mostró la mayor actividad antirradical con un porcentaje de limoneno del 60,23%. Por lo tanto, el aceite prototipo tenía un valor IC50 más bajo con una actividad antioxidante más alta del 57% a una concentración de 100 μL, como se observó previamente con compuestos naturales similares35. Los resultados del ensayo ABTS in vitro confirmaron los resultados de DPPH (Fig. S2).

Ensayo de eliminación de DPPH. Control de vehículo VEH, aceite esencial aislado de hidrodestilación Clevenger convencional CCH, aceite esencial aislado prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado para GC/MS de doble función DF-GC/MS-HUS, VC 500 μg/ml de vitamina C, “*” significa significativo ( p < 0,05) en comparación con el control del vehículo (n = 3).

El índice de refracción se calcula para determinar la pureza de los A.E., los valores de los aceites esenciales aislados convencionales CCH y DF-GC/MS-HUS presentan un rango de RI entre 1.4705 y 1.4725 como se muestra en la Tabla 5, y de acuerdo a la Según la Asociación de Aceites Esenciales (EOA), los estándares RI para aceites esenciales deberían estar entre 1,4723 y 1,4737. El RI del aceite CS extraído (1,4725) se encuentra dentro del rango especificado por la EOA y concuerda con otros estudios realizados anteriormente con otros aceites esenciales CS29,36. Los valores de densidad relativa de varias muestras de CS E.Os son casi los mismos, como se muestra en la Tabla 5. Además, según la Organización Internacional de Normalización (normas ISO 4735-2002), la densidad relativa de los aceites esenciales debe estar dentro de un rango entre 0,848 y 0,855 g/mL (“ISO—ISO 4735:2002—Aceites de cítricos—2002.). La densidad relativa de varias muestras de CS E.O oscila entre 0,849 y 0,852 y se encuentra en el rango específico de ISO. Nuestros hallazgos también están en línea con un estudio37, que encontró el rango del índice de refracción entre 0,845 y 0,851. El equivalente fenólico total se determinó utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu y se expresó como equivalente de ácido gálico en mg/100 μL y los resultados se presentan en la Tabla 5. El equivalente fenólico total osciló entre 0,291 y 0,783 mg/100 ml de OE. El equivalente fenólico total fue más en el prototipo de DF-GC/MS-HUS aislado CS EO que en el CCH aislado CS EO (Tabla 5), ​​y varios estudios informan que cuanto mayor es el contenido fenólico, mayor es la actividad antioxidante en los aceites esenciales38. Así, el aceite aislado prototipo presentó los mayores contenidos de polifenoles de 0,783 mg/100 mL (Cuadro 5), y mostró una mejor actividad antioxidante de 57,0 ± 0,01% utilizando el método in vitro DPPH, y 58,90 ± 0,01% utilizando el método in-vitro. Método CAT vivo (Figs. 3, 4). Por otro lado, el CCH EO convencional ha mostrado menores contenidos de polifenoles 0,362 mg/100 ml (Tabla 5), ​​y mostró una actividad antioxidante comparativamente menor de 36,00 ± 0,01 % utilizando el método DPPH in vitro, y 23,60 ± 0,01 % utilizando el método DPPH in vitro. el método TAC in vivo (Figs. 3, 4). Por lo tanto, el aceite prototipo fue predominante en contenido fenólico y potencial antioxidante in vitro e in vivo, en comparación con el método de aislamiento convencional.

Varias muestras de CS EO estaban libres de bacterias, ya que varias muestras de EO no mostraron crecimiento bacteriano. Además, las actividades antibacterianas de los AE CS aislados de DF-GC/MS-HUS y CCH se evaluaron por separado frente a cuatro cepas bacterianas, estudiadas mediante el método de difusión en disco (Tabla 6). Los diversos CS EO inhibieron significativamente el crecimiento bacteriano (p <0,05) utilizando el método de difusión en disco con eficacia variable. El aceite prototipo fue el único que mostró actividad contra E. coli (zona de inhibición del crecimiento de 11 mm). Los aceites convencionales y prototipo han mostrado una actividad antibacteriana significativa en bacterias grampositivas que varían de 8 a 13 mm, seguidas por las cepas de bacterias gramnegativas con una actividad antibacteriana máxima de 11 mm (Fig. 5). Esto se debe a la diferencia en la estructura de su pared celular, lo que hace que las bacterias gram negativas sean más resistentes al AE que las bacterias gram positivas; estos resultados coincidieron con estudios anteriores38. Las importantes actividades antibacterianas de los aceites convencionales y prototipo podrían deberse a contenidos elevados de limoneno y monoterpenos oxigenados39. Ambos aceites han mostrado aproximadamente el mismo efecto sobre L. monocytogenes (8 mm y 9 mm respectivamente) y sobre S. aureus (13 mm y 11,5 mm respectivamente), sin efecto antibacteriano sobre P. aeruginosa (Fig. 5). Nuestros resultados coinciden con estudios publicados previamente32,40. Se seleccionaron los aceites esenciales de CS más prometedores que mostraron un efecto antibacteriano contra las cepas bacterianas grampositivas y gramnegativas analizadas para la determinación de los valores de CIM (presentados en la Tabla 6), ya que los valores de CIM mostraron variabilidad entre los mismos tipos de A.E.41. En este estudio, la CIM del prototipo CS EO para E. coli registró un valor alto (50 mg/mL) en comparación con el valor de CMI (2,5 mg/mL) para bacterias gram positivas (S. aureus y L. monocytogenes). , nuestros resultados coinciden con otros estudios que muestran que los aceites esenciales mostraron variabilidad en su actividad antimicrobiana entre diferentes microorganismos6. Varios factores pueden causar una diferencia en el potencial antibacteriano del aceite esencial, como la variabilidad de los compuestos del aceite y la estructura de las paredes celulares bacterianas42. Además, el prototipo de AE ​​ha demostrado un mayor efecto inhibidor contra bacterias grampositivas que el aceite convencional, con valores de CMI de 3,125 mg/ml para S. aureus y 12,5 mg/ml para L. monocytogenes. Esto podría estar relacionado con el mayor porcentaje de limoneno en el prototipo EO41.

Visualización microscópica del efecto de los A.E. sobre la biopelícula (a) Staphylococcus aureus (b) Listeria monocytogenes (c) E.coli en comparación con el control. C. O2: aceite esencial aislado por hidrodestilación Clevenger convencional. EO: Prototipo de aceite esencial aislado de hidrodestilación asistida por ultrasonido optimizado para GC/MS de doble función.

En la industria nutracéutica, la biopelícula bacteriana representó un grave problema de higiene, haciendo que las bacterias gram positivas y gram negativas sean más resistentes a los desinfectantes y agentes antimicrobianos43. Muchos AE han demostrado una potente supresión de la formación de biopelículas al promover la separación celular44. Nuestros resultados han demostrado que tanto los AE convencionales como los prototipos fueron capaces de interrumpir la formación de biopelículas de las tres cepas bacterianas analizadas (E. coli, S. aureus y L. monocytogenes), lo que resultó en una disminución significativa de la densidad celular. fijación en la superficie de los cubreobjetos de vidrio (Fig. 5). Nuestros resultados son consistentes con otros estudios que muestran que las biopelículas fueron fuertemente inhibidas por los A.E. donde el daño subletal de la pared celular puede influir negativamente en el primer paso en la formación de biopelículas, que es la unión bacteriana a las superficies43. Así, el prototipo y los AE aislados convencionales han mostrado una alteración significativa de la biopelícula bacteriana, lo que tiene una aplicación práctica para mantener la higiene de la industria nutracéutica de forma natural y segura.

En este estudio, los aceites esenciales de CS se aislaron utilizando el prototipo DF-GC/MS-HUS y los métodos convencionales CCH. Los dos métodos se compararon en cuanto al tiempo de extracción, el rendimiento y la composición del aceite esencial. El mayor rendimiento de aceite se obtuvo utilizando la técnica prototipo, mejorando la composición del aceite, con un tiempo de aislamiento y un consumo de energía mínimos, lo que reduce la carga para el medio ambiente. También se evaluaron los potenciales antioxidantes in vitro e in vivo, los polifenoles totales, el índice de refracción, la densidad relativa, la actividad antibacteriana y la inhibición de biopelículas. Los componentes principales del prototipo aislado de CS-EO fueron limoneno (81,32%), β-mirceno (7,55%) y α-pineno (4,20%). Ambos aceites investigados produjeron importantes potenciales antioxidantes in vitro e in vivo, siendo el más alto el del prototipo CS EO aislado. El aceite prototipo fue predominante en contenido fenólico y potencial antioxidante in vitro e in vivo, en comparación con el método de aislamiento convencional. El importante potencial antioxidante del prototipo de AE ​​podría deberse a su mayor contenido de polifenoles totales, en comparación con el AE convencional. Los índices de refracción y los valores de densidad relativa de las dos muestras de aceite se encuentran en el rango especificado según las normas EOA e ISO, respectivamente. Se ha demostrado que ambos aceites esenciales están libres de bacterias y tienen potenciales antibacterianos naturales para minimizar el crecimiento bacteriano e inhibir la formación de biopelículas por S. aureus, L. monocytogenes y E. coli. El prototipo y los AE aislados convencionales han mostrado una alteración significativa de la biopelícula bacteriana, lo que tiene una aplicación práctica para mantener la higiene de la industria nutracéutica de una forma natural y segura. En comparación con el método de hidrodestilación convencional, el método prototipo DF-GC/MS-HUS ha acortado el tiempo de aislamiento en un 83,3%, ha reducido el consumo de energía, sin producción de dióxido de carbono, al reducir las temperaturas de extracción a más de la mitad, lo que protege a los termolábiles. componentes, aumentó la cantidad en 2514 veces y mejoró la calidad de la composición CE-EO. Por lo tanto, el método prototipo DF-GC/MS-HUS se considera una nueva técnica ecológica que minimizó la utilización de energía con mayor eficiencia. En el futuro se realizarán más experimentos para evaluar otros métodos ecológicos para la valorización de subproductos naturales.

Los conjuntos de datos analizados durante el estudio actual no están disponibles públicamente debido a un acuerdo con la agencia de financiación LIRA, pero están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Aceites esenciales

cítricos sinensis

Prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonidos

Prototipo de hidrodestilación asistida por ultrasonidos

Hidrodestilación Clevenger convencional

Microlitro

La concentración inhibidora media máxima

Límite máximo de residuos

Concentración mínima inhibidora

Índice de refracción

Agar Mueller Hinton

Aceite esencial comercial CS número dos

Asociación de aceites esenciales

Organización Internacional de Normalización

La capacidad de aislamiento

La concentración de aceite esencial en cualquier momento t (min)

La constante de tasa de aislamiento de primer orden.

La constante de tasa de aislamiento de segundo orden.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por Libanese Industrial Research Achievements (LIRA), el Ministerio de Industria y el Instituto de Investigación Industrial (IRI).

Esta carta es para confirmar que los autores recibieron financiación para la investigación del proyecto titulado "Método novedoso para la valorización de aceites esenciales a partir de subproductos de CS".

Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Árabe de Beirut, Tariq El Jedidah, Riad El Solh, PO Box: 115020, Beirut, 1107 2809, Líbano

Roudaina Abdel Samad, Nada El Darra y Alissar Al Khatib

Departamento de Ingeniería Industrial y Gestión de Ingeniería, Facultad de Ingeniería, Universidad Árabe de Beirut, Riad El Solh, PO Box 11-5020, Beirut, Líbano

Hadi Abou Chacra

Departamento de Alimentos, Instituto Libanés de Investigación Agrícola, PO Box 2611, Fanar, Beirut, 1107 2809, Líbano

Adla Jammoul

Laboratorio de Fitofarmacia, Ministerio de Agricultura del Líbano, Kfarchima, Líbano

Adla Jammoul

Departamento de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Farmacia, Universidad Pharos en Alejandría, Alejandría, Egipto

Karim Raafat

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RAS realizó algunos trabajos experimentales, participó en la adquisición de datos y escribió parcialmente el manuscrito. NED participó en la conceptualización de la idea, el diseño de la metodología, la interpretación de datos, la redacción del borrador del manuscrito original y la revisión final del manuscrito. AAK ayudó con el análisis microbiológico y la redacción del manuscrito. HAC participó en la adquisición de datos, análisis de datos, interpretación de datos, redacción del manuscrito, revisión crítica y revisión final del manuscrito. NED participó en la conceptualización de la idea, el diseño de la metodología, la interpretación de los datos, la redacción del borrador del manuscrito original y la revisión final del manuscrito. AJ proporcionó algunas instalaciones de laboratorio y revisó el manuscrito. KR es el autor correspondiente, realizó algunos experimentos, proporcionó las instalaciones del laboratorio y participó en el diseño de la metodología, la interpretación de los datos, la redacción y el análisis del manuscrito y la revisión final del manuscrito. El Autor cede al editor los derechos de publicación no exclusivos.

Correspondencia con Karim Raafat.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Abdel Samad, R., El Darra, N., Al Khatib, A. et al. Nueva hidrodestilación asistida por ultrasonido asistida por GC/MS de doble función para la valorización de subproductos de Citrus sinensis: análisis fitoquímico y actividades antibacterianas. Informe científico 13, 12547 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38130-9

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Recibido: 25 de marzo de 2023

Aceptado: 03 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38130-9

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